Una característica distintiva de las neoplasias hematológicas como el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) es la heterogeneidad, con la contribución del tumor y su microambiente. La aplicación de tecnología de secuenciación de próxima generación a biopsias de tumores de pacientes reveló no solo fundamentos genéticos y epigenéticos de la heterogeneidad intrínseca del tumor [1, 2], sino también las complejidades del microambiente tumoral (TME). Además, el microambiente del linfoma se ha caracterizado mediante inferencia computacional o técnicas de citometría digital a partir de grandes colecciones de datos de expresión del gen DLBCL. [3, 4]. Estos análisis demostraron que, a pesar de carecer de una estructura clara de los compartimentos tumorales/inmunitarios que se encuentran en los tumores sólidos, el linfoma TME no es una variedad aleatoria de células tumorales y inmunes. Creemos que la relación espacial entre el tumor y las células inmunes infiltradas es una pieza que falta en nuestra comprensión.
Los avances tecnológicos en imágenes cuantitativas de alta complejidad, como las imágenes por haz de iones multiplexados (MIBI) y la citometría de masas por imágenes (IMC), han proporcionado no solo mediciones cuantitativas de marcadores proteicos sino también imágenes de alta resolución para revelar relaciones espaciales entre tumores y no tumorales infiltrados. células, complementando datos transcriptómicos masivos. Un ejemplo temprano de dicho estudio evaluó 30 marcadores proteicos en 33 casos de LDCBG según el IMC. [5] y encontró nueve vecindarios celulares (CN). Sin embargo, faltaba una caracterización detallada de estos NC. Utilizando datos MIBI en una cohorte de DLBCL, Wright et al. Identificación recientemente informada de seis tipos de vecindad celular y tres microambientes inmunes a tumores agregados. [6]. Aquí, ampliamos este enfoque y caracterizamos sistemáticamente los patrones espaciales del tumor y las principales células inmunes infiltrantes en DLBCL recién diagnosticado utilizando MIBI junto con análisis de imágenes cuantitativos para proporcionar una caracterización detallada de estos CN, describir sus redes espaciales y vincularlos con los resultados clínicos ( Figura 1a).
a Diseño del estudio y flujo de análisis. b Composición del tipo de célula de cada grupo de vecindad celular (CNC). Los CNC se ordenan aumentando el contenido tumoral. C Redes de contexto espacial agregadas en todas las muestras de la cohorte A. Cada CNC se representa como un nodo coloreado, con tamaños de nodo proporcionales al número total de CNC en las muestras. Los bordes entre dos CNC se muestran si >10% de los CN dentro de los dos CNC estaban muy cerca. El espesor del borde (peso) es proporcional a este porcentaje de proximidad entre pares de CNC. Los bordes propios no están incluidos para mayor claridad visual. d Pesos de los bordes de la red de contexto espacial (fracción de CN dentro de cada CNC muy próximos) entre los CN ricos en tumores y todos los demás CN, para cada muestra de la cohorte A. Esta es una representación cuantificada de los pesos de los bordes que se muestran en Centre los CN ricos en tumores y todos los demás CN. y Expresión relativa de marcadores funcionales en los ocho CNC, para la cohorte A. Los CNC se clasifican según la abundancia de células inmunitarias y se etiquetan como inmunes ricos e inmunes escasos. F La expresión de PD-L1 o IDO-1 en células tumorales dentro de cada muestra. pag valores de la prueba pareada de Wilcoxon.
Generamos datos MIBI para dos cohortes de DLBCL: la cohorte A consta de 27 casos recién diagnosticados y 3 casos de recaída de un estudio clínico en BC Cancer, y los pacientes fueron seleccionados para un número igual de pacientes que lograron y no lograron una supervivencia libre de progresión de 24 meses ( SPF). Los datos de PFS después del tratamiento con R-CHOP estaban disponibles, junto con las características iniciales de la enfermedad y FISH para MYC, BCL2y BCL6 reordenamiento (Tabla S1). Patólogos certificados seleccionaron manualmente tres regiones de interés (ROI) de toda la sección para cada muestra y las analizaron con un panel de 33 marcadores (Tabla S2). La selección de ROI tuvo como objetivo la diversidad dentro del tejido tumoral en lugar de simplemente áreas ricas en tumores. De manera similar, se seleccionaron de 3 a 5 ROI para la cohorte B, que consta de 55 casos recién diagnosticados del mundo real sin datos clínicos y analizados en un panel MIBI de 17 marcadores (Tabla S3). Ambas cohortes tenían datos de RNAseq, lo que permitió una clasificación molecular basada en la expresión génica. [7]. Describimos nuestros hallazgos principalmente en la cohorte A, pero también destacamos observaciones consistentes entre las dos cohortes.
El análisis y la cuantificación de imágenes MIBI, realizados por IonPath Inc., (Menlo Park, CA), identificaron 31 fenotipos celulares únicos en la cohorte A. A continuación, siguiendo en gran medida los métodos de Bhate et al. [8]Calculamos los CN que consisten en cada célula y sus 20 vecinos más cercanos, para nueve tipos de células inmunes relativamente abundantes (Tabla S4) más células tumorales, lo que resultó en un total de 643,114 y 532,755 CN en las dos cohortes, respectivamente.
La agrupación de K-medias de las composiciones celulares de CN produjo ocho CNC únicos que fueron notablemente consistentes entre ambas cohortes (Fig. 1b y Fig. S1). Los CN dentro de cada CNC están enriquecidos con diferentes tipos de células inmunes infiltrantes, que denominamos con contenido tumoral ascendente como: rico en CD4 (33% tumor), rico en CD68-CD163+ mac (38%), rico en DC (40% ), rico en CD8 (44%), rico en Treg (53%), rico en mac doble positivo (CD68+CD163+) (60%), rico en mac CD68+CD163− (67%) y rico en tumores (87%). En las figuras 2b y S2 se visualizan ejemplos de ROI MIBI coloreadas según su composición CNC.
a Composición de CNC por muestra de paciente para la cohorte A. La agrupación jerárquica de la composición de CNC separó las muestras en cuatro “subtipos” o CNST (barras apiladas superiores). Las siguientes tres barras apiladas anotan estas muestras según su estado de supervivencia libre de progresión a los 36, 24 y 9 meses; seguido del estado de la firma del microambiente tumoral (clasificador TME); estado de doble golpe/triple golpe (DH/TH) por FISH y estado de DLBCL COO por NanoString. Muestras de recaída R/R, N/A indeterminada. b Visualización de ROI de cuatro muestras de los cuatro CNST resaltados en la Fig. 2a. Arriba: ubicaciones de tipos de células individuales (primarias). Abajo: celdas individuales coloreadas según su asignación CNC. C Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier basado en PFS para CNC rico en mac de doble posición mediante prueba de clasificación logarítmica de división de mediana pag Se muestra el valor.
Mediante el análisis del contexto espacial, que mide las proximidades entre los CN, encontramos que los CN dentro del CNC rico en CD4 son los más segregados de los del CNC rico en tumores (Fig. 1c, d). Mientras tanto, los CN supuestamente supresores, incluidos aquellos en los CNC ricos en Treg y ricos en mac doble positivo, son más espacialmente proximales a los CN en el CNC rico en tumores (Fig. 1c, d). Esta estructura espacial, que también es sugerida por la mezcla variable de células tumorales/inmunitarias entre los CNC, como se muestra en la figura 1b, sugiere que las células B del tumor DLBCL reclutan o están rodeadas por un microambiente inmunológico supresor.
También encontramos diferencias en la composición inmune entre los dos subtipos de células de origen (COO) de DLBCL. En relación con las muestras del subtipo GCB, las muestras del subtipo ABC están más enriquecidas para los CNC ricos en mac CD68-CD163+ (pag= 0,008), mientras que las muestras de GCB tienen menos CNC inmunes ricos y más CNC inmunes escasos, lo que concuerda con datos publicados anteriormente [9]. Además, al contrastar el contexto espacial entre el subtipo ABC y GCB, encontramos que los CNC ricos en CD8 en ABC son más próximos a los ricos en mac CD68-CD163+ (pag= 0,002) y rico en DC (pag= 0,02) CNC (Fig. S3a y Fig. S3b). Como describimos a continuación, es más probable que estos dos últimos CNC sean positivos para PD-L1 (Fig. 1e) y, por lo tanto, sean inmunosupresores.
Estos hallazgos nos motivaron a examinar los patrones de expresión de marcadores celulares entre los CNC. Observamos patrones de expresión específicos de CNC de ciertos marcadores funcionales (Fig. 1e). Por ejemplo, la expresión de los ligandos inmunosupresores PD-L1 e IDO-1 fue mayor en general en los cuatro CNC inmunes ricos que en los cuatro CNC inmunes escasos, particularmente dentro de los CNC ricos en DC. La expresión específica de CNC de estos marcadores inmunosupresores también se asocia con la expresión de marcadores de agotamiento y/o activación de células T (PD-1, LAG3, TIM3, GZMB) (Fig. 1e), indicativos de un fenotipo de supresión inmune. Las células tumorales también expresan estos marcadores en niveles significativamente más altos en los cuatro CNC inmunes ricos en comparación con los CNC inmunes escasos (pag
Cada muestra varía en su composición de CNC, y la agrupación jerárquica de la composición de CNC por muestra da como resultado cuatro subtipos de pacientes primarios (CNST) (Fig. 2a). Este análisis reveló varios paisajes inmunes/tumorales de DLBCL distintos: un subtipo altamente inmune caracterizado por CNC ricas en células T y CNC ricas en macrófagos CD68-CD163+ (CNST-1); un subtipo de tumor mixto caracterizado por CNC ricos en células dendríticas y macrófagos CD68+CD163− (CNST-2); un subtipo rico en tumores que también tiene CNC ricos en macrófagos dualmente positivos (CNST-3); y un subtipo dominado por CNC rico en tumores (CNST-4). Utilizando los mismos métodos, obtuvimos cuatro CNST similares en la cohorte B (Fig. S4), aunque la proporción relativa de estos cuatro CNST varía entre las dos cohortes. En la Fig. 2b se ilustran ejemplos de ROI de muestras seleccionadas de cada CNST.
Investigamos si los CNC y/o CNST están asociados con firmas moleculares de alto riesgo o resultados clínicos en la cohorte A. El CNC de macrófagos doble positivo se asocia significativamente con una SSP más corta (orden logarítmico). pag= 0,004) (Fig. 2c y Fig. S5). En consecuencia, CNST-3, que está enriquecido con CNC rico en macrófagos dualmente positivos, se asocia con una SSP más corta (SSP ≤ 9 meses [enrichment p = 0.02], figura 2a). El subtipo COO y el doble impacto/triple impacto de FISH no se correlacionaron significativamente con CNC o CNST. Como era de esperar, los casos con clasificador TME positivo (inmune alto) [7] están enriquecidos en CNST-1 inmune rico (enriquecimiento pag= 0,01).
Nuestro trabajo tiene similitudes con una publicación reciente que aplica el análisis MIBI a DLBCL [6], incluida la identificación de CN enriquecidos en células dendríticas y macrófagos, lo que indica la solidez de estos análisis. La solidez de nuestro análisis se ve reforzada al mostrar coherencia entre CNC y CNST en dos cohortes independientes. Esto nos permite informar detalles novedosos que arrojan luz sobre características potencialmente clínicamente relevantes del DLBCL TME.
Dividiendo los macrófagos en tres subpoblaciones distintas según los marcadores CD68 y CD163 y la biología conocida de los macrófagos asociados a tumores. [10], podríamos asignarlos a diferentes CNC que reflejen diferencias funcionales. En particular, demostramos que los CN de macrófagos doblemente positivos se asocian con un resultado clínico deficiente y encontramos un subtipo de paciente enriquecido con esta población de macrófagos (CNST-3). Nuestro resultado es consistente con informes anteriores de que niveles más altos de CD68+CD163+ (también conocidos como macrófagos supresores o similares a M2) confieren un mal pronóstico en el DLBCL. [10,11,12].
Dado que siete de cada ocho CNC contienen al menos un tipo de célula inmune infiltrante, una pregunta fundamental es cómo los tumores DLBCL escapan a la eliminación inmune, y se propusieron tres mecanismos. [13]. En primer lugar, está bien documentado que las células tumorales pueden lograr un escape inmunológico a través de mutaciones extensas en los componentes del complejo MHC. [14, 15]. Nuestro análisis revela un mecanismo adicional: las células tumorales tienden a permanecer físicamente aisladas de las células T auxiliares, que desempeñan un papel esencial como antígeno. En segundo lugar, los tejidos tumorales a menudo están enriquecidos con células inmunosupresoras como los macrófagos CD68+CD163+ y las células T reguladoras, y mostramos que las células tumorales se rodean espacialmente de células inmunosupresoras. En tercer lugar, las células tumorales pueden expresar ligandos supresores como PD-L1 o IDO-1, expresados canónicamente por células inmunitarias. Mostramos que esta expresión aberrante es más prominente cuando el tumor está rodeado de células inmunes en lugar de otras células tumorales. La forma en que DLBCL adquiere estas disposiciones espaciales favorables es probablemente a través de interacciones tumor-TME y se necesita más investigación para detallar esto.
En resumen, mediante la aplicación de técnicas de imágenes proteómicas de vanguardia y análisis de vecindad celular, hemos descubierto patrones espaciales que reflejan interacciones dinámicas entre el tumor DLBCL y el linfoma TME, y su asociación con el resultado clínico. La exploración de estas relaciones espaciales puede conducir a nuevos enfoques de terapia inmunooncológica.
