El recorrido expositivo se estructura en torno a diferentes historias y las obras se distribuyen en 11 salas, con el objetivo de acercar al visitante a la evolución social, política y artística de España durante más de cuatro siglos, desde el reinado de Carlos V hasta sus inicios. del siglo XX durante una época relevante de la Restauración. En este afán didáctico se han incluido géneros como la mitología, la naturaleza muerta, la pintura religiosa, el retrato o el desnudo, que evocan la Sala Reservada que existió en el Museo del Prado durante sus inicios como museo.
Se conservan ocho pinturas del siglo XVI, entre las que destaca la Mona Lisa, fechado entre 1507-1516, un óleo sobre tabla procedente del taller de Leonardo da Vinci, que se expone junto a un dibujo de Juan Antonio del Canto, de finales del siglo XVIII, y dos fotografías de 1871 y 1915, que ayudan a comprender mejor esta obra. . Y también El cambista y su esposa. (1539) de Marinus van Reymeswaele; Venus recreando con Amor y Música (hacia 1555) de Tiziano; un retrato de Juan Sánchez Cotán, Brígida del Río, la Barbuda de Peñaranda (1590); Isabel de Valois sosteniendo un retrato de Felipe II (1561-1565), óleo de Sofonisba Anguissola; un par de paneles de Juan de Flandes; él Sacrificio de Isaac de Veronés; y Las tentaciones de San Antonio Abad de un seguidor de Hieronymus Hieronymus, fechado alrededor de 1550-1560.
El siglo XVII, núcleo central de la selección pictórica, es uno de los mejor representados con más de una treintena de óleos de maestros como El Greco, con el que Retrato de un joven caballero (1600-1605) y Cristo abrazando la cruz (1602); cuatro composiciones de Velázquez con ese retrato de Felipe IV, cazador (1632-1634), La fuente de los Tritones en el Jardín de la Isla de Aranjuez (1657) y su entrañable enano con un perro (hacia 1645) y El bufón de calabaza (1635-1639); la versatilidad de Rubens y su taller en Mercurio (1636-1638), Fortuna (1636-1638), Diana Cazadora (1617-1620) o El rapto de Hipadamia (1636-1637); un par de zurbaranos; Murillo, Ribera, Jacques Jordaens, por citar los más relevantes.
Y de los siglos XVIII y XIX con algunos ejemplos del XX, de Sorolla y un paisaje de Beruete, cabe destacar ocho obras de Francisco de Goya: Carlos IV (hacia 1789), Cardenal Don Luis María de Borbón y Vallabriga (hacia 1802), parasol (1777), el retrato de Francisco de Bayeu (1795) y escenas como La ermita de San Isidro el día de la fiesta, la corrida de toros (1780) o aquellos muchachos recogiendo frutas (1778).
Y también óleos de Jean Ranc como La familia de Felipe V (hacia 1723); él retrato de Amalia de Sajonia (ca. 1761) de José del Castillo y Antón Rafael Mengs; un óleo de Antonio Carnicero; el retrato de Sabina Seuphan Spalding que le hizo Federico de Madrazo en 1846; dos composiciones de Lucas Velázquez; él Desnudo en la playa de Portici (1874) de Mariano Fortuny; y la luz que emana del Desembocadura del Bidasoa (1872), que Martín Rico plasmó con su paleta.
